Dicas básicas para a criopreservação de culturas celulares

Dicas básicas para a criopreservação de culturas celulares

As células continuam seu metabolismo durante as atividades normais de crescimento, o que requer a participação de várias proteases. Quando a temperatura cai abaixo de -70 ° C, as proteases param de funcionar. Portanto, em um ambiente com temperaturas extremamente baixas, as células podem interromper suas atividades metabólicas e entrar em um estado adormecido que permite armazenamento a longo prazo.

1. Materiais experimentais

Material base:

Meio de cultura básica

Soro (fbs/nbs convencionais)

Ultrapure Workbench

Dimetilsulfóxido estéril (DMSO)

Solução estéril de salina de tampão de fosfato PBS

Pistola de pipeta

Pistola de pipeta elétrica

Preparação dos experimentos

a) Preparação da solução de congelamento:

Células gerais: 55% de meio basal + 40% de soro bovino (FBS/NBS) + 5% DMSO

Células vitais: soro bovino a 90% (FBS/NBS) + 10% DMSO

Alíquota A solução de criopreservação preparada em um tubo de centrífuga de 15 mL [ninho] e armazene a 4 ° C para uso posterior.

(b) Preparação de células para serem congeladas:

Antes de congelar as células, selecione as células com bom status de crescimento e na fase de crescimento logarítmico e substitua-as por meio fresco 12-24 horas antes de congelar para manter a condição celular.

2. Procedimento experimental

1. Observe a densidade das células a serem congeladas, que é de cerca de 80%~ 90%. Use uma pistola para aspirar o meio antigo, adicione PBS estéril para lavar as células 1-2 vezes e remova o meio restante no ambiente de cultura.

2. Adicione uma quantidade apropriada de tripsina ou suco digestivo para permitir que a tripsina insira as células e coloque -as na incubadora para digestão. Observe a condição das células sob o microscópio: o citoplasma está se retraindo e as células não estão mais conectadas em folhas. Neste ponto, adicione a solução de parada para interromper o processo de digestão.

3. borbulham delicadamente as células com uma ponta para formar uma suspensão de células e centrifugar a suspensão de células a 1000 rpm por 3-5 minutos.

Descarte o sobrenadante, adicione uma quantidade apropriada de solução de congelamento e pipeta delicadamente para fazer com que as células contem uniformemente. Ajuste a densidade celular com meio de criopreservação para tornar a densidade final 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml.

4. Use uma pistola para separar os tubos criogênicos de acordo com a capacidade esperada e use uma máquina de capeamento automática para limitar e selar.

5. O programa padrão de criopreservação é uma taxa de resfriamento de -1 ° C a -2 ° C/min, e as células a serem congeladas podem ser gradualmente congeladas de acordo com as seguintes etapas: temperatura ambiente → 4 ° C (20min) → - 20 ° C (30min) → -80 ° C ° C (durante a noite) → armazenamento a longo prazo em nitrogênio líquido.

Também pode ser armazenado diretamente em um freezer a -80 ° C durante a noite e depois transferido para nitrogênio líquido para armazenamento.

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