Problemas de vedação e contaminação em placas de cultura de células multiwell

Carregando e manuseio de placas de cultura de células de vários poços:

A placa de cultura de células também segue o princípio da rigoroso assepsia ao executar operações celulares. Todas as operações devem ser padronizadas e científicas e não causarão impacto adicional no crescimento celular. O problema mais comum é como garantir a uniformidade das células após adicionar a amostra e minimizar o impacto da alteração do meio no estado de crescimento das células.

perguntar:
As tampas de placas de cultura de 96 e 24 poços ou placas de Petri são muito soltas, o que é conveniente para a ventilação, mas bactérias, mofo e outros poluentes também entrarão?

responder:
A tampa é muito solta, que pertence à cultura semi-aberta, e o objetivo disso é ventilar (de fato, é fazer o CO2 fora do prato de cultura trocar totalmente com o prato de cultura e manter o valor do pH da cultura médio).
Tudo tem vantagens e desvantagens, o que obviamente aumenta a possibilidade de poluição. Além disso, isso faz com que o líquido no prato evapore, o que é notável para a dosagem precisa dos medicamentos. Portanto, são necessárias duas medidas a seguir: a. O ar na incubadora deve estar limpo (luz ultravioleta regular, lavagem de álcool e a incubadora deve ser aberta e fechada o mínimo possível) b. A umidade na incubadora deve sempre ser mantida a 100% (a pia com água destilada estéril colocada na incubadora).
Assim como uma placa de Petri, também é um recipiente com uma tampa de cabeça para baixo e não será poluída. Principalmente devido à pressão negativa do fluxo de ar gerado pela borda "L" da tampa, existem microorganismos presos à poeira, e a poeira transportada pelo fluxo de ar não pode passar pela borda da tampa que gera pressão negativa. O efeito de ventilação é somente através da difusão do ar, e nenhum fluxo de ar será gerado, portanto, apenas respira e não penetrará nas bactérias.

perguntar:
Usando uma placa de 24 poços, existem operações em alguns dos poços (no banco ultra-limpo) e há células a serem cultivadas em outros poços. Estou preocupado que isso cause contaminação. Eu não sei o que prestar atenção?

responder:
Se a operação for padronizada no banco ultra-limpo, deve estar ok. Eu acho que você pode fazer pleno uso da capa da placa de cultura, tente expor apenas os orifícios a serem operados e cobrir os outros orifícios com tampas.
Considere de forma abrangente antes do uso e faça pleno uso de todos os orifícios; Se você precisar usar apenas alguns orifícios, poderá usar apenas um lado e cobrir o restante com uma tampa. Estou acostumado a usar o orifício certo primeiro (é conveniente adicionar amostras à mão direita).

Ao operar, use alguns slides de vidro para elevar um lado da placa, não abra completamente a tampa, geralmente sem problemas.
Distribuição e soluções desiguais

perguntar:
As células são inoculadas na placa de cultura, e as células sempre se reúnem na parte periférica, como lidar com isso?

responder:
Posso perguntar como suas células são mistas? É pipeta ou sacudir a placa de cultura? Se for o último, e se for agitado em círculo, é muito provável que as células sejam jogadas para a parte periférica devido à força centrífuga, resultando em menos células no meio. Mais de quatro semanas!
Aqui está uma boa maneira: antes de cultivar a placa de semente, coloque a placa de cultura na incubadora por algumas horas de saturação e depois retire -a. A força deve ser leve ao plantar as células. Adicionar lentamente permite que a suspensão celular flua para os poços da placa, e as células cultivadas basicamente crescem uniformemente. Lembre -se de nunca tremer com um agitador, ou suas células se agruparão como você disse.
Quanto menor o diâmetro do orifício da placa de cultura, mais óbvio é esse fenômeno. Esse fenômeno é inevitável para placas de 24 e 96 poços, porque o líquido adere à parede, de modo que a solução de cultura no poço não forma um nível de líquido, mas a periferia é alta, assim como um espelho côncavo. No entanto, ao usar esses dois tipos de placas de orifício, não é possível adicionar quantidade suficiente de solução de cultura devido à necessidade de intervenção adicional, para que as células apareçam "coleta de arestas" juntamente com a solução de cultura. Depende de quais indicadores você precisa observar. Se for MTT, a imuno -histoquímica afetará os resultados devido a camadas celulares.
Ao digerir células, preste atenção à pipeta uniformemente para evitar grupos de células e a quantidade de solução de cultura no poço deve ser suficiente. Geralmente, adicione solução de cultura suficiente ao inocular e altere a solução uma vez ao adicionar intervenção. A quantidade de solução de cultura adicionada à solução de intervenção é igual à quantidade de solução de cultura no momento da inoculação; nesse caso, o fenômeno do "conjunto de borda" será melhorado; portanto, você pode tentar.

perguntar:
O que eu fiz foi o experimento de formação da placa. É melhor espalhar as células em uma camada uniforme. A maioria dos orifícios é boa quando o vírus é inoculado e alguns deles não são uniformes. Existem grandes diferenças no grupo celular. Eu gostaria de perguntar qual método você usa ao adicionar células?

responder:
É fundamental para piçar as células em uma suspensão única após a digestão! Certifique -se de que o número de células em cada poço seja consistente ao dividir a placa!
Obviamente, também existem fatores de processamento. O paralelismo entre os poços também é muito importante. Por exemplo, ao adicionar remédio, misture o medicamento após a diluição para garantir que a concentração de cada poço seja consistente!
Além disso, ao adicionar células e medicamentos, o grupo de teste e o grupo controle devem ser adicionados, por sua vez, para evitar a diferença na densidade celular e na concentração de medicamentos causada pela sequência de adicionar amostras!

perguntar:
O sopro já é uniforme, mas os 6 orifícios e 24 orifícios são sempre um pouco desiguais e um pouco concentrados no meio. Além disso, é óbvio que a contagem é feita e, após um dia ou dois, a densidade de cada orifício é diferente, o que afetará a detecção. Existe uma boa maneira?

responder:
Se você usar uma pipeta pasteur, não chupa muito a cada vez, porque as células da pipeta afundam automaticamente, geralmente o número de células nos primeiros orifícios é grande, e a suspensão de células é frequentemente uniforme, e o líquido irá Siga a rota da forma S.
Se você usar uma pipeta, as pontas devem ser processadas e removidas para evitar danificar as células, para que cada vez que o líquido seja retirado corresponda a um poço. É mais preciso adicionar um orifício individual com a ponta. Mas também preste atenção à mistura da suspensão.

Para configurar um grupo paralelo, N deve ser grande o suficiente (você pode calculá -lo).

Não agite após o revestimento, pois o tremor fará com que as células se agreguem em direção ao centro. É melhor prancha uma vez.

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